支原體基因組DNA提取試劑盒（離心柱法）說明書

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產品詳情

產品描述

《支原體基因組 DNA 提取試劑盒》（離心柱法）（Mycoplasma Genomic DNA Extraction Kit with Columns）的操作方法和試劑配方已經針對支原體的特點做了優化，專門用于從體外培養的細胞、細胞上 清、血清、血漿、全血、生物制品等樣品中提取支原體基因組 DNA。提取的支原體基因組 DNA 可用于《一 步法恒溫支原體檢測試劑盒》、《PCR 法支原體檢測試劑盒》和《探針法支原體檢測試劑盒》。

支原體基因組 DNA 的提取有兩個作用：

（1）可以去除所有可能抑制 PCR 擴增的成分或者干擾《一步法 恒溫支原體檢測試劑盒》顯色的成分，保證后續 PCR 擴增的正常進行或者《一步法恒溫支原體檢測試劑盒》 的顯色不被干擾；

（2）具有濃縮支原體 DNA 的作用，可以提高相對檢測靈敏度 10-100 倍。

產品組分

蛋白酶 K 溶液：Proteinase K（20 mg/mL） 1 mL

溶液 GR：Buffer GR 15 mL

溶液 GL：Buffer GL 15 mL

清洗液 GW1：Buffer GW1(Concentrate) 13 mL

清洗液 GW2：Buffer GW2(Concentrate) 15 mL

洗脫液 EB：Elution Buffer EB 15 mL

吸附柱：Spin Columns DM 50 個

收集管：Collection Tube 50 個

使用方法

使用方法

1.實驗前準備及重要注意事項

1) Buffer GW1 和 Buffer GW2 的配制：第一次使用前，應按照試劑瓶標簽的說明先在 Buffer GW1 和 Buffer GW2 中加入無水乙醇，并在試劑瓶標簽中做好標記。

2) 使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉淀，如有結晶或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水 浴孵育重新溶解。

2. 樣品處理：本試劑盒優選體外培養的細胞上清（貼壁細胞直接取細胞培養上清、懸浮培養細胞取低速 離心后的離心上清）、血清、血漿、溶液型生物制品作為提取支原體基因組 DNA 的樣品。如果是粉末 型樣品，需用水溶解后，再進行后續操作。

注 1：體外培養的貼壁細胞培養上清或懸浮細胞，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 5 分鐘后（切 記：此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取離心后上清進行檢測。

注 2：如果初始樣品是加了抗凝劑的全血，經 1200 rpm（約 150 g）低速離心 10 分鐘后（切記： 此步驟離心力不能太大，否則支原體會被離心去除了！），取上層血漿進行檢測。

注 3：如果初始樣品是未加抗凝劑的全血，待血液凝固后，取血清進行檢測。

3. 取上述細胞上清、血清、血漿、生物制品等樣品 200 μL，用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。

注 1：當樣品量小于 200 μL 時，加入 Buffer GR 補足至 200 μl，再進行下一步實驗。

注 2：如果預期待測樣品支原體含量較少（比如長期低溫保存的血清、血漿、胰酶、生物制品等）， 可以取上述樣品 1 mL，加入 1.5 mL 離心管內，13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 分鐘。吸走 離心后的上清 800 μL，剩余 200 μL 用移液槍吹吸均勻后，進行后續操作。此步驟起濃縮支原體的 作用，從而提高支原體檢測的相對靈敏度。如果需要，上述樣品的體積可以進一步放大，經過多 次高速離心后，剩余 200 μL 用于后續操作（比如，如果初始體積是 5 mL，經 5 次高速離心，取剩 余的 200 μL 進行后續操作，最終用 50 μL 洗脫液進行洗脫，則支原體 DNA 大約濃縮了 100 倍，支 原體檢測的相對靈敏度也大約提高了 100 倍。）

4. 向以上溶液中加入 20 μL Proteinase K（20 mg/mL）溶液，混勻。

5. 加入 200 μL Buffer GL（如果室溫較低，使用前請檢查 Buffer GL 是否出現結晶或者沉淀，如有結晶 或者沉淀，請將 Buffer GL 于 56?C 水浴孵育重新溶解），用吸頭充分吹吸均勻或用 Vortex 充分震蕩。

注意：不要將 Proteinase K 和 Buffer GL 進行預混，否則 Proteinase K 可能失活。

6. 將離心管放置 56?C 水浴，孵育 15 分鐘。

注意：此步驟不能省略！

7. 加入 2 μL 支原體 qPCR 內參質粒 mycoIC2（注意：內參質粒 mycoIC2 請吹吸均勻后，再加入。內參質粒 mycoIC2 只在本公司《探針法支原體檢測試劑盒》內含有，如果使用其他支原體檢測方法，本步驟可以 跳過！）。

注 1：此步驟只有使用本公司《探針法支原體檢測試劑盒》時，需要加入支原體 qPCR 內參質粒 mycoIC2。

注 2：加入的內參質粒 mycoIC2 用于監控支原體 DNA 的提取和后續支原體 qPCR 的擴增是否有效。

8. 加入 200 μL 無水乙醇，上下顛倒混勻數次。 l 注意：此處不能高速離心！如果需要（一般不需要離心），只能 1000 rpm（約 100 g）低速短暫 離心（20 Sec），使管壁和壁蓋上的液體集中到管底。

9. 用 1 mL 吸頭將所得溶液全部（含管壁和蓋子上溶液）加入到已裝入收集管的吸附柱(Spin Columns DM） 中。12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。

10.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW1（使用前檢查是否加入無水乙醇!）,蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒 一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱 重新放回收集管中。

11.向吸附柱中加入 500 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛 倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附 柱重新放回收集管中。

12.再次清洗：向吸附柱中加入 600 μL Buffer GW2（使用前檢查是否加入無水乙醇!），蓋上蓋子，將吸附柱快速顛倒一次（目的：清洗管壁和蓋子中的雜質），12,000 rpm 離心 1 分鐘，倒掉收集管中的廢 液，將吸附柱重新放回收集管中。

13.繼續 12,000 rpm 離心 2 分鐘。離心后，在亮光下，仔細檢查吸附柱內部吸附膜上方的塑料墊圈四周是 否有液體殘留。如果發現吸附柱內部塑料墊圈四周有液體殘留，可以將吸附柱放回收集管內，將有液 體殘留的一側放在離心力內側，繼續 12,000 rpm 離心 1 分鐘。

14.離心后，經仔細檢查，如果確認吸附柱內部塑料墊圈四周沒有液體殘留，則可以丟棄收集管，將吸附柱 置于一個新的 1.5 mL 離心管（自備）中，打開吸附柱蓋子，置于 50-65℃的烘箱內放置至少 15 分鐘， 以讓吸附膜中的乙醇揮發干凈（請務必放在 50-65℃的烘箱內放置！如果室溫放置，不僅時間需要 延長，還不排除有些樣品由于乙醇揮發不干凈，影響后續 PCR 擴增效率，甚至失敗）。

注意：打開吸附柱蓋子，將吸附柱放在 50-65℃的烘箱內至少 15 分鐘，此步驟非常關鍵！如果沒 有烘箱，強烈建議購買一個。這一步的目的是將吸附膜中殘余的乙醇去除，乙醇的殘留會嚴 重影響后續的酶促反應（如：酶切、PCR 擴增等），甚至可能導致后續的 PCR 失敗。

15.向吸附柱的中間部位懸空加入 50 μL Elution Buffer EB，室溫放置 3 分鐘，12,000 rpm 離心 1 分鐘， 收集 DNA 溶液，-20℃保存。

運輸及保存方法

該產品常溫運輸，室溫保存（收貨后，其中的 Proteinase K 放-20?C 保存）。該條件下，至少 3 年內有 效。Proteinase K 溶液可以在室溫保存 2-3 個月，長期保存需要放-20?C。